【导读】

全球干细胞治疗产业正进入高速发展期。根据全球市场调研机构Global Market Insights Inc.发布的报告，干细胞治疗市场增势迅猛，2025年预计将达到150亿美元。我国干细胞治疗也正迎来从实验室研究转化为成熟市场产品的技术成果转化时期，制约干细胞技术转化的关键技术亟待突破。

用于人体疾病治疗的干细胞产品对细胞的数量、品质和稳定性都有极高要求。一般来说，成人细胞移植的单次剂量必须达到10^8-10^9个细胞才能有效。而为了获得稳定治疗效果，还必须保证干细胞治疗产品的安全性、有效性和质量稳定[1]。临床剂量级别且功能良好的干细胞体外扩增培养技术一直是干细胞治疗发展的瓶颈。目前仍然缺乏可以同时解决以下几个问题的稳定体外扩增平台：

（1）高贯通性孔隙结构，可均匀吸纳大量干细胞；

（2）稳定的多级仿生结构，保障干细胞高速生长代谢的物质交换；

（3）无损化的收集方法，以获得功能良好的细胞/细胞团簇。

近日，清华大学姚睿特聘研究员团队和捷诺飞生物创始人徐铭恩教授团队在最新的一期ACS Biomaterials Science & Engineering上合作发表了Front Cover封面文章Three Dimensional Printing of Hydrogel Scaffolds with Hierarchical Structure for Scalable Stem Cell Culture[2]，原创性的提出基于3D打印技术构建具有四级仿生结构的三维支架进行干细胞规模化扩增的方法。该3D打印干细胞扩增支架：

（1）具有独特可控的贯通性微观孔隙和宏观通道结构，可均匀吸纳大量干细胞，并保障细胞高速生长代谢中的物质交换（种植后细胞存活率达98.9%）。
（2）具有良好的力学性能，可实现长期体外培养（弹性模量是水凝胶支架的22倍）。
（3）可在无损细胞表型和功能的前提下快速收集细胞。

（4）最短仅需4天，即可扩增得到2×10^8个胚胎干细胞，到达临床使用所需细胞数量的级别。

                 本研究作为期刊封面（Front Cover）

如封面图片所示，该干细胞扩增平台像一座大楼，干细胞可以被快速吸纳到每个房间进行增殖/分化，有多种通道保障营养物质的供应和代谢废物的排出，最终整个大楼可被温和的拆除，释放出所有扩增好的干细胞。

研究人员采用了一种新的生物3D打印技术—打印同步光学相干层析技术（printing OCT，pOCT）。生物3D打印技术可基于计算机CAD模型，定位组装生物材料，制造适合细胞扩增的仿生结构。然而，由于生物材料的刚性低，导致打印结构误差巨大，无法支撑标准化、规模化制备的需求。pOCT技术能在打印过程中对打印结构进行实时无损监测和计算，通过反馈控制降低打印误差，并可精准控制交联度调控材料微观结构，实现生物材料的高保真、标准化、规模化打印。集成pOCT技术的生物打印系统（Regenovo, Bio-architect X）由捷诺飞生物科技开发。

                     

研究示意图

研究人员打印了两种生物材料：海藻酸钠和明胶，基于pOCT技术精确控制打印过程并调控交联度，然后程序性冻干，获得了具有四层等级结构的支架。该支架宏观上为直径1cm的6层网格支架；中间具有直径约1.3mm的贯穿的中空通道；每根微丝的直径为300um左右；微丝内分布着平均直径为100um的贯通性大孔隙。这种独特的层级结构实现了整个结构对干细胞的大量均匀吸纳，并提供充足的细胞增殖空间，保障高效的氧气和代谢物交换，为干细胞的大规模、快速扩增奠定基础。

                    

 支架的多层级结构

研究人员分别选择了两种干细胞：肝脏祖细胞（HepaRG）和小鼠胚胎干细胞（ESCs）进行规模化培养。两种细胞种植后均在支架内部生长成团且分布均匀。HepaRG在支架上培养了7天后增殖了13.8倍，ESCs在培养4天后增殖了11.4倍。在生理状态下对支架进行温和的解交联技术，可方便地收集大量细胞团簇。HepaRG细胞团簇阳性表达成熟肝细胞的标志性蛋白，ESCs细胞团簇阳性表达多能性蛋白和钙黏蛋白。收集细胞操作对细胞的活性和表型都没有影响，且均获得2×10^8个以上的细胞数量，达到临床所需移植细胞量。

             

支架培养和无损收集ESCs

这一原创性技术还展示了3D打印支架对不同干细胞选择性培养模式：HepaRG出现了增强的肝细胞分化，而ESCs维持了多能性。研究人员认为其源于3D打印支架本身的独特性。支架提供的微环境可以：

（1）增强细胞与细胞间的相互接触

（2）支架的力学性能（压缩模量约为11 kPa）接近于健康人体肝脏组织的刚度

（3）相互贯穿的中空通道增强了氧气和营养物质的交换，为肝祖细胞提供了高氧的环境；从而促进HepaRG的肝向分化。而对于ESCs，支架的基体材料之一：明胶是ESCs培养的主要基质，为胚胎干细胞提供了良好的生长环境；此外，3D支架培养促进了黏附蛋白的表达，从而维持ESCs多能性。这一特性显示本平台可以进行多种类型细胞大规模扩增的应用潜力。

本研究提出了一种全新的3D打印辅助干细胞规模化扩增技术，研究结果显示干细胞扩增效率高、表型稳定、可控性强、稳定性好、收集方便，可应用于多种细胞的体外规模化培养，为干细胞治疗、组织器官缺损修复及其他生物治疗领域提供了新的解决思路。相关技术已申请多项专利，正在进行技术转化工作，敬请关注。

论文信息：

[1] Chen, R.; Li, L.; Feng, L.; Luo, Y.; Xu, M.; Leong, K. W.; Yao, R. Biomaterial-Assisted Scalable Cell Production for Cell Therapy. Biomaterials 2020, 230, 119627.
[2] Feng. L., Liang S., Zhou Y., Luo. Y., Chen. R., Huang. Y., Chen. Y., Xu. M., Yao. R. Three Dimensional Printing of Hydrogel Scaffolds with Hierarchical Structure for Scalable Stem Cell Culture. ACS Biomater. Sci. Eng. 2020, 6, 5, 2995-3004.